穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建實驗

  穩(wěn)定表達細胞株（穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株）指在細胞中持續(xù)穩(wěn)定表達特定基因或干擾特定基因表達。穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的目的基因質(zhì)粒DNA整合到細胞染色體上，使細胞長期穩(wěn)定表達該基因。

 在基因功能的研究中，基因是否有效轉(zhuǎn)染靶細胞，是功能研究的前提條件之一。而穩(wěn)定表達細胞株則彌補了瞬時感染（或轉(zhuǎn)染）一些功能實驗中由于外源基因表達時間短的缺陷，便于長期觀察基因?qū)τ诩毎δ艿挠绊懸约暗鞍组g相互作用。

用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒或病毒侵染的方法將構(gòu)建好的含靶基因的載體導(dǎo)入細胞，根據(jù)不同的基因載體中所含的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物進行篩選混合陽性克隆。在陽性混合克隆的基礎(chǔ)上，得到單細胞長出的陽性單克隆，繼而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。常用的真核表達載體的抗性標(biāo)志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。

上海生物有著多年構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的經(jīng)驗，已在H1299、THP-1、MCF7/ADR、A549、V79、MC3T3-E1、CHO、SiHa、3D4/2、HL7702、SW480、HepG2、SGC-7901、MGC-803、HT-29、Saos-2、U-2os、PC12、SK-BR-3、MCF-7、HMSC-ad 、GIST-T1、HEK293、293T等多個種屬細胞中成功構(gòu)建過表達和RNAi穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。
   產(chǎn)品特點：
   1、穩(wěn)定：15代以內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞穩(wěn)定表達。
   2、迅速：一般控制在1個月以內(nèi)完成構(gòu)建。
   3、經(jīng)濟：價格實惠，性價比高。
   4、質(zhì)量：對外源基因進行嚴格鑒定。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建實驗的兩種方法
   1、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，單克隆方法篩選穩(wěn)定細胞系。對大多數(shù)細胞轉(zhuǎn)染效率較低。對于基因過表達，如果轉(zhuǎn)染效率達到40%，基因過表達尚可。但是對于基因干擾實驗，對轉(zhuǎn)染效率要求遠遠高于基因過表達，通常質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無法滿足。另外，質(zhì)粒游離于細胞質(zhì)中，很快降解，無法滿足較長時間的檢測項目；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合幾率極低，穩(wěn)定細胞株構(gòu)建耗時耗力，且得率很低，往往需要挑取單克隆株。

   2、病毒感染篩選穩(wěn)定細胞株
  病毒感染方法較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選單克隆方法更方便和高效，是目前主流的穩(wěn)定細胞系篩選方法。用慢病毒制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，由于其高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達、宿主范圍廣，感染效率高，且與細胞染色體整合而不發(fā)生基因重排，是制備穩(wěn)定細胞株的理想載體。

  穩(wěn)定表達細胞株構(gòu)建服務(wù)流程
   1、載體構(gòu)建：將外源基因構(gòu)建到合適的載體上，如需病毒轉(zhuǎn)染，則包裝病毒。
   2、篩選濃度測定：以 10-14 天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度。
   3、細胞接種：轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細胞應(yīng)達到 60%-80% 覆蓋。
   4、細胞轉(zhuǎn)染：用構(gòu)建好的載體（或包裝好的病毒）轉(zhuǎn)染目的細胞。
   5、抗生素篩選。
   6、鑒定篩選結(jié)果。

   客戶需要提供
   1、構(gòu)建好的外源基因載體或基因模板。
   2、待轉(zhuǎn)染的細胞系（ 1×106 個細胞，可傳代，倍增時間小于 48 小時），特殊細胞需提供培養(yǎng)基。
 
我們提供
   1、構(gòu)建好的外源基因載體。
   2、構(gòu)建好的穩(wěn)定細胞系。
   3、構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株實驗報告及相關(guān)的外源基因表達分析。

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